Determinación de la concentración de hemoglobina

FUNDAMENTO
Determinar la cantidad de hemoglobina en sangre, utilizando la técnica de la cianmetahemoglobina, mediante cálculos y mediante curva de calibración.

MATERIAL
Tubos de ensayo
gradilla
espectrofotómetro
micropipeta
pipeta (5ml) y prepipeta
cubetas de espectrofotómetro.
REACTIVOS: Hemoglobin 50X (Ferricianuro de potasio (0'60mmol/l), cianuro de potasio (77mmol/l) y dihidrogeno fosfato de potasio (2mmol/l)) y patrón de hemoglobina (a diferentes concentraciones).

MUESTRA
Sangre venosa anticoagulada

PROCEDIMIENTO
- Preparamos la siguiente bateria de pruebas
- Mezclamos e incubamos 3 minutos a temperatura ambiente
- Preparamos las cubetas rotulándolas igual que los tubos de ensayo
- Configuramos el espectofotómetro de la siguiente manera:
longitud de onda 540nm, volumen 100, temperatura y tiempo 0.
- leemos la absorvancia de cada cubeta en el espectofotómetro y anotamos los resultados.
- Una vez anotados los datos realizamos una curva de calibración.

Recuento leucocitos

MATERIAL
Pipeta de Thoma
Tubo de goma con boquilla para pipeta
Cámara de recuento
Cubre
Reactivos: líquido de dilución Turck.(produce la lisis de los eritrocitos sin alterar los leucocitos. Tambien tiñe el nucleo de éstos con el violeta genciana que contiene)

MUESTRASangre capilar o venosa anticoagulada

PROCEDIMIENTO
- Aspiramos la sangre con la pipeta de Thoma hasta 1 y con líquido diluyente hasta 11
- Agitamos con movimientos suaves unos 3 minutos
- Desechamos las tres primeras gotas
- Depositamos una gota entre la cámara y el cubre
- Contamos los leucocitos presentes en los 4 cuadros grandes de las esquinas, cada uno dividido en 16 cuadritos. Se cuentan con el objetivo de 10x

LECTURA DE RESULTADOS
Como se cuentan los leucocitos en 4 cuadros grandes hay que dividir por 4 la cantidad obtenida en el recuento, y así sabremos el número de leucocitos en un cuadrado grande.

Cada cuadro mide 1mm de lado, por eso multiplicamos por 10.

Como la sangre la diluimos, hay que multiplicar el resultado anterior por 10 si se ha enrasado hasta 10 y por 20 si se ha enrasado hasta 0.5.


WBC = L/4 x 10 x 10 ( o 20 )


INTERPRETACION CLINICA
La disminución del WBC se produce en las leucopenias, su aumento se da en la leucocitosis.
Se considera normal un WBC entre 5.000 y 11.000 leucocitos por mm cúbicos.
CON MICROPIPETA haríamos una dilución de 1/10

Indice de lobularidad

MATERIAL
2 Portas
Bolígrafo y papel para el cálculo de los resultados
Reactivos: Líquido de inmersiónMUESTRA
Frotis muy fino teñido con panóptico rápido.

PROCEDIMIENTO
- Observamos el frotis con el objetivo de inmersión.

- Contamos las lobulaciones de cada neutrófilo encontrado (Se considera que hay un lobulo cuando una parte del núcleo está unida al resto solamente por un fino puente de cromatina)
- Clasificamos los neutrófilos según Arneth, y contar los lóbulos de cada neotrófilo hasta llagar a los 100 neutrófilos.

LECTURA DE RESULTADOS
IL= nº lóbulos contados / nº neutrófilos observados.

Detección de crioglobulinas

FUNDAMENTO
La detección de crioglobulinas se basa en la exposición del suero problema a la acción de una temperatura baja (4ºC)
Si el suero problema contiene crioglobulinas, éstas precipitan con el frío, y el precipitado formado adopta el aspecto de partículas blanquecinas

MATERIAL
Pipeta Pasteur
Tubo de ensayo
Gradilla
Baño de agua
Capilar no heparinizado (azul)
Plastilina
Centrífuga hematocrito
Lector de microhematocrito

MUESTRA
Suero transparente, obtenido de sangre coagulada completamente a temperatura corporal y separado del coágulo en un ambiente cálido.
Es importante evitar que la coagulación se produzca en un ambiente frío, pues esto puede dar lugar a la formación de una pequeña cantidad de crioglobulinas.


PROCEDIMIENTO
- Depositamos el suero problema en un tubo de ensayo y centrifugamos a 3500 rpm durante 15 minutos
- Colocamos el suero a unos 4ºC y observamos durante 6 dias.


LECTURA DE RESULTADOSSi aparecen partículas blanquecinas en el suero, lo incubamos a 37ºC. Tras la incubacion, si no desaparecen las particulas , se considera que éstas se deben a restos de fibrina . Cuando estas desaparecen se estima que son crioglobulinas precipitadas (prueba positiva).

En el caso en que la prueba sea positiva, puede realizarse una semicuantificación de las crioglobulinas presentes en el suero, mediante la determinación del CRIOCITO.

Para medir el criocito:

- Cogemos de la nevera (4ºC) un tubo capilar hematocrito y llenamos las 3/4 partes de éste con suero problema
- Centrifugamos a 10500 rpm 5 minutos
- Calculamos el % de la columna de precipitado de crioglobulinas y el ocupado por el suero total en forma de porcentaje.

Recuento de plaquetas con hemocitometro

FUNDAMENTO: Con esta práctica vamos a llevar a cabo un recuento de plaquetas por milímetro cúbico

MATERIAL
Tubo de ensayo
Pipeta de Thoma con tubo y boquilla
Cámara de recuento
Gasas
Cubreobjetos
Placa Petri
Papel de filtro

REACTIVOS: agua destilada y liquido de dilución: lab. Spinreact
MUESTRA: Sangre capilar o venosa recientemente extraida y anticoagulada.


PROCEDIMIENTO

- Vertemos 1ml de sangre en un tubo de ensayo y 1ml de líquido de dilución en otro
- Con la pipeta de Thoma enrasamos con sangre hasta 1 y hasta 101 con el líquido de dilución.
- Agitamos suavemente unos 5 minutos
- Desechamos las 5 primeras gotas
- Cargamos la cámara de recuento y la colocamos en el interior de una cámara húmeda donde vamos a dejarla reposar 15 minutos
- Observamos al microscópio con el objetivo de 10x y 40x.

- Enfocamos un cuadro grande y contamos el total de plaquetas que hay en él.

La fórmula es:
PLT/mm3 = P x D x V = P x 1.000

P ... nº de plaquetas en un mm3
V... correción de volumen (10)
D... correcion de dilución (100)

Recuento de plaquetas en frotis

INTRODUCCIÓN
En el recuento de plaquetas (PLT o PLQ) determinamos el número de trombocitos presentes en 1mm cúbico.
Un recuento con contadores electrónicos sería más exacto, pero de esta forma tá,bien podemos hacer un estudio morfológico de los trombocitos.

MATERIAL
Portaobjetos para frotis
Papel y bolígrafo
Reactivo: líquido de inmersión


MUESTRA
Frotis teñido con panóptico rápido.

PROCEDIMIENTO
- Observamos el frotis con el objetivo de inmersión
- Contamos las plaquetas presentes en 10 campos microscópicos
- Calculamos la cifra media del número de plaquetas contadas en los 10 campos


PLT/mm3 = PLT/C x 20.000


INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOSDebe haber 1 plaqueta por cada 10 - 20 hematíes, 5 - 25 trombocitos por campo.
Si el nº de plaquetas por mm3 de sangre es inferior a 130.000 hay una trombocitopenia
Si es superior a 400.000 hay una trombocitosis.

Recuento de hematíes

FUNDAMENTO
Se diluye la sangre problema y se cuentan los hematíes en algunos cuadrados de los retículos de la cámara.

INTRODUCCIÓN
El RBC consiste en la determinación del número de eritrocitos presentes en un volumen determinado de sangre, generalmente en 1 mm3

MATERIAL
Pipeta diluidora de Thoma para glóbulos rojos con tubo de goma
Cámara de recuento
Cubre
Microscópio

REACTIVOS: líquido de Hayem

MUESTRA
Sangre venosa

TÉCNICA
- Con la pipeta de Thoma aspiramos con sangre hasta 0.5 si creemos que hay una policitemia o hasta  si creemos que hay anemia.
- Aspiramos hasta 101 con líquido Hayem
- Agitamos 2 o 3 minutos suavemente para homogeneizar la mezcla y desechamos las 3 primeras gotas
- Depositamos una gota entre el cubre y la cámara en ambos lados de ésta
- Enfocamos con el objetivo de 40x y contamos los hematíes presentes en 80 cuadros del grande central. Para ello contamos las esquinas y el centro, Debemos contar los hematíes situados dentro de los cuadros y los situados arriba y a la derecha, de este modo no contaremos dos veces los mismos hematíes.


LECTURA DE RESULTADOSSi hay disminución del RBC habrá una anemia, si por el contrario aumentase nos encontrariamos con una policitemia.
Un RBC normal se situa entre 4 y 5.5 en mujeres y entre 4.5 y 6 en hombres.