FUNDAMENTO
Con esta práctica vamos a separar las moléculas de la hemoglobina mediante la electroforesis
MATERIAL
Gradilla
tubos de centrífuga
pipeta pasteur y graduadas,
centrífuga,
material para electroforesis
rodillo y placa de vidrio
agitador
REACTIVOS: suero fisiológico, agua destilada, solución decolorante (ácido acético 5%), solución transparentadora (metanol+ciclohezanona+ácido acético glacial), cloroformo, metanol, tampón pH 8'8, colorante (negro amido).
MUESTRA
Preparado de sangre hemolizada
PROCEDIMIENTO
- Realizamos el hemolizado de la siguiente manera:
Ponemos 3 ml de sangre anticoagulada en 2 tubos de centrífuga.
Centrifugamos a 3500 rpm durante 10 minutos y retiramos el sobrenadante.
Añadimos 4-5 ml de suero fisiológico, homogeneizamos y volvemos a centrifugar.
Lavamos 3 veces más (en total realizamos 4 lavados)
En el último lavado, nos quedamos con el sedimento (aproximadamente 1 ml).
Al sedimento le añadimos medio volumen de cloroformo y 1'5 volumenes de agua destilada (en nuestro caso al tener 1 ml de sedimento añadimos 0'5 ml de cloroformo y 1'5 ml de agua destilada) y volvemos a homogenizar.
Volvemos a centrifugar pero a 3500 rpm durante 20 minutos.
Cogemos el sobrenadante (hemolizado) y lo añadimos en un tubo de ensayo, ya que es la muestra que necesitamos.
- Ponemos la solución tampón en la cubeta y colocamos una tira de cellogel en la cubeta y lo empapamos de tampón durante 10 minutos.
- Preparamos la fuente de alimentación, la cubeta y los electrodos correctamente (el rojo es el ánodo (+) y el negro es el cátodo (-)).
- Sacamos la tira de la cubeta, la secamos un poco con papel de filtro
- Colocamos la tira en el puente de manera que la cara absorbente esté hacia arriba (ponemos la esquina cortada en la derecha y mirando hacia nosotros).
- Sabiendo que el hemolizado irá del cátodo al ánodo, pondremos una marca lo más cerca del cátodo para indicar dónde colocaremos la muestra.
- Empapamos un capilar con el hemolizado y dónde hemos colocado la marca añadimos una línea fina de hemolizado.
- Tapamos la cubeta y ponemos en marcha el alimentador, a 400 voltios durante 15 minutos.
- En una bandeja, ponemos negro amido, en otras tres ponemos ácido acético al 5 %, en otra metanol y en otra solución transparentadora.
- Pasado el tiempo de la electroforesis, colocamos la tira de cellogel (boca abajo) en la bandeja de negro amido, durante 10 minutos y agitando la bandeja (lo colocamos en un agitador).
- Pasado el tiempo, colocamos la tira en la bandeja de ácido acético y hacemos 3 lavados de 10 minutos en total (también agitándolo).
- Pasado el tiempo, colocamos la tira en metanol durante 1 minuto.
- Colocamos la tira en la solución transparentadora entre 2 y 3 minutos.
- Sacamos la tira de la solución transparentadora, la colocamos en una placa de vidrio (cara absorbente hacia abajo) y la aplastamos con el rodillo.
- Colocamos la placa de vidrio en la estufa hasta que la tira quede transparente (5-6 minutos).
LECTURA DE RESULTADOSNo se han podido diferenciar bandas en nuestra práctica.
